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| 發(fā)布時間： | 2023-12-21 04:01 |
| 最后更新： | 2023-12-21 04:01 |
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蛋白質(zhì)表達以后，在發(fā)揮真正功能之前，會經(jīng)過多種不同的翻譯后修飾，例如，磷酸化，乙?；?，糖基化等基團修飾。本文主要講下兩種研究蛋白磷酸化修飾的方法：Western Blot和質(zhì)譜檢測法。
蛋白質(zhì)翻譯后修飾種類
蛋白磷酸化修飾過程
蛋白磷酸化修飾這一過程是通過蛋白激酶催化，將磷酸基團從ATP轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨酸、蘇氨酸，或酪氨酸殘基上。并且磷酸化修飾的過程是可逆的，去磷酸化反應由蛋白磷酸酶催化完成。
蛋白質(zhì)磷酸化修飾反應過程
蛋白磷酸化檢測方法
目前，蛋白磷酸化的檢測方法有很多種，本文將著重講解兩種檢測蛋白磷酸化的方法：Western Blot和質(zhì)譜分析法。
一 、Western Blot檢測方法
Western Blot是檢測蛋白磷酸化水平的常用方法，主要過程為先利用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用特異性識別磷酸化蛋白的抗體來鑒定目標蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修飾的蛋白才會在相應分子質(zhì)量的地方顯現(xiàn)特異性蛋白條帶。
Western Blot實驗過程
Western Blot蛋白磷酸化檢測結(jié)果
Western Blot檢測方法優(yōu)勢：
1-. WB方法簡便，多數(shù)實驗室具備Western Blot設備條件。
2. 許多磷酸化抗體十分靈敏，能夠檢測低至10ug的蛋白樣品。
3. 對于豐度低的蛋白，可以先通過IP使用目標蛋白的抗體對目標蛋白進行富集，再進行WB檢測被磷酸化的蛋白，檢測效率可以提高幾倍甚至幾十倍。
Western Blot檢測方法缺點：
1-. 特異性磷酸化抗體難以制備，許多特異性位點的磷酸化檢測受限。
2. 測定的磷酸化水平受樣品處理和凝膠上樣的誤差影響。
3. 獲取多個蛋白質(zhì)磷酸化的位點信息會受限。
二、質(zhì)譜檢測方法
Western Blot的方法簡便，對于大規(guī)模分析復雜的生物樣品的磷酸化水平就不再適用了。而質(zhì)譜卻能很好的解決這一問題。依靠高精準度質(zhì)譜儀，如今快速準確分析細胞中高豐度蛋白的磷酸化修飾已是非常簡單的事。具體的檢測方法為先通過SDS-PAGE膠，或者2D-PAGE膠等分離目標蛋白，將含有目標蛋白的條帶切下，胰酶消化，LC-MS/MS檢測分析蛋白序列和相應位點的磷酸化修飾。這個方法適用于檢測多個目標蛋白的磷酸化水平。對于磷酸化豐度相對較低的目標蛋白，我們也能采取像下圖中固定化金屬親和層析IMAC等方法來富集磷酸化的肽段，再使用質(zhì)譜對富集的蛋白進行分析。
磷酸化蛋白富集和質(zhì)譜檢測
質(zhì)譜檢測方法優(yōu)勢：
1-. 精準度高，能夠檢測多個蛋白的多個磷酸化位點。
2. 適用于大規(guī)模分析蛋白磷酸化水平。
3. 不依賴于磷酸化抗體。
質(zhì)譜檢測方法缺點：
1-. 設備要求較高，通常需要借助專業(yè)質(zhì)譜分析機構(gòu)。
2. 測序結(jié)果分析相對復雜，需要依賴專業(yè)分析軟件，以及生物信息技術平臺。
在實際應用中，Western Blot與質(zhì)譜分析方法各有各的好，誰也無法完全被另一種方法所替代。在選擇測定磷酸化修飾的時候還應該根據(jù)具體需要來決定。如果研究的蛋白正好有商業(yè)化的磷酸化抗體，那么lucky you，你可以選擇Western Blot進行快速磷酸化測定研究。如果你所研究的蛋白質(zhì)沒有可用的商業(yè)化磷酸抗體，或是抗體價效過低，亦或是需要大規(guī)模地檢測細胞內(nèi)磷酸化蛋白的水平的話，質(zhì)譜檢測會是更好地選擇。
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